:飼料原料中酸溶蛋白的測定方法研究

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樓主 2019-06-30 23:08:22
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發酵、酶解粕類和植物蛋白主要是將其中的大分子蛋白降解為小分子蛋白、多肽和小肽,從而提高其在動物體內的消化率和機體的免疫力。小分子蛋白含量是評價發酵、酶解粕類蛋白質品質的主要指標之一,在飼料行業中通常使用三氯乙酸酸溶蛋白(TCA-N)作為常規檢測方法。有研究表明使用酸溶蛋白含量指標評價發酵、酶解粕類蛋白質品質,既可以反映其中抗原蛋白質和其他蛋白質抗營養因子被水解的程度,進而揭示該類抗營養因子活性被消除的程度,又可一定程度上反映肽含量的高低。


農業部于2012年6月1日發布并于2013年1月1日起正式施行的《飼料原料目錄》(農業部公告第1773號,以下簡稱《目錄》)中規定,針對不同的原料進行“強制性標識要求”,并要求“規定的質量要求或衛生特征指標應在原料標簽的分析保證值等項目中列出”;針對部分單一飼料品種,除對常規的粗蛋白質、粗灰分、水分等指標要進行標識外,“酸溶蛋白”也要進行標識。而根據《目錄》的通則要求,對屬于單一飼料品種范疇的產品“應當辦理生產許可證和進口登記證”,而在辦理上述許可文件過程中,均存在對強制性標識項目的控制指標規定和檢測的要求。但由于此前沒有對“酸溶蛋白”進行強制性標識的要求,多數此類飼料原料的生產企業并未給予關注,對該項目進行控制指標的規定更是知之甚少。對此,本研究通過查閱相關參考資料,對不同檢測方法——過濾法和離心法進行比較研究,最終確定飼料原料中酸溶蛋白的檢測方法,并通過實際樣品測定,給出部分產品中酸溶蛋白的檢測結果,為上述飼料原料生產和經營企業規定酸溶蛋白的控制指標提供參考。

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? 范圍

由表1可以看出,《目錄》對大米酶解蛋白、玉米酶解蛋白、大豆酶解蛋白、棉籽酶解蛋白等4種飼料原料除了常規的粗蛋白質、粗灰分和鈣含量的標識外,還規定了酸溶蛋白的標識要求(三氯乙酸可溶蛋白)。對發酵豆粕、發酵棉籽蛋白和釀酒酵母發酵白酒糟等3種飼料原料,除了常規的粗蛋白、水分、粗纖維等指標的標識外,也規定了酸溶蛋白的標識要求。具體規定見1。


在上述7種單一飼料原料中,目前僅有發酵豆粕已發布產品標準《飼料原料發酵豆粕》(NY/T 2218-2012),其中對酸溶蛋白規定其占粗蛋白質含量要大于(或等于)8.0%,標準中同時確定了發酵豆粕中酸溶蛋白的檢測要按《大豆肽粉》(QB/T 2653-2004)中規定的方法執行。

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?原理及標準

酸溶蛋白即分子量較低的蛋白水解物,包括肽和游離氨基酸,主要是指可溶于酸性(三氯乙酸)溶液的蛋白,故又名三氯乙酸可溶蛋白。分子量較大的蛋白遇酸會沉淀,分子量較小的蛋白可溶于三氯乙酸,據此特性可以確定其測定原理:利用大分子蛋白質在三氯乙酸(TCA)溶液中沉淀,除去酸不溶蛋白質,然后測定酸溶蛋白,即將酸溶蛋白與硫酸和催化劑一起加熱消解,使蛋白質分解,其他步驟和內容參見粗蛋白的測定。

對應于上述定義和原理,在不同產品標準中對酸溶蛋白的測定步驟的規定如下。


輕工業標準《大豆肽粉》?

在輕工業標準《大豆肽粉》QB/T 2653-2004中對酸溶蛋白檢測步驟為:稱取樣品2.00 g,加入15%TCA(三氯乙酸)溶液10 mL,混合均勻,靜置5 min。將溶液定量轉移,在4 000 r/min離心下10 min后,取全部上清液,按食品中蛋白質的測定規定的方法測定上清液可溶蛋白質。


國家標準《大豆肽粉》

在國家標準《大豆肽粉》GB/T 22492-2008中對酸溶蛋白檢測步驟為:準確稱取樣品1.0 g(精確至0.001g),加入15%三氯乙酸(TCA)溶液溶解并定容至50 mL,混勻并靜置5 min,過濾,去除初濾液,濾液作為備用液。吸取10.00~25.00mL濾液,以下步驟按照粗蛋白測定的步驟進行即可。


農業行業標準《飼料原料 ?發酵豆粕》

農業行業標準《飼料原料 發酵豆粕》NY/T 2218-2012中對酸溶蛋白的檢測規定為:按QB/T 2653規定的方法執行。

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? 材料與方法
儀器與試劑

儀器:BS 210S電子天平(德國Sartorius公司);ZM 100旋風磨(德國Retsch公司);FOSS 2300半自動凱氏定氮儀及其消煮爐裝置(丹麥Foss公司)。

試劑:三氯乙酸、無水乙醚、鹽酸、硼酸、硫酸、氫氧化鈉(均為分析純),凱氏定氮高效催化劑片(北京金元興科科技有限公司)。具體參照GB/T 6432-1994規定的方法配制。


測定方法

參考上述3個產品標準,對QB/T 2653-2004GB/T 22492-2008標準中規定的檢測方法進行比較分析發現,2個方法在樣品前處理階段除稱樣量、溶液體積和消解液體積不同外,分離方式也存在差別,為考察標準中涉及的前處理方式對結果的影響,結合實際情況,設計了3種前處理方式,具體內容如下:

    方法1:稱取2.0 g試樣,溶于10 mL 15%三氯乙酸溶液,4 000 r/min離心10 min,取全部上清液消化,其余同粗蛋白質的測定(QB/T 2653-2004);?

    方法2:稱取1.0 g試樣,溶于50 mL 15%三氯乙酸溶液,磁力攪拌30 min,過濾,取10 mL濾液消化,其余同粗蛋白質的測定(參考GB/T 22492-2008);?

    方法3:稱取0.5 g試樣,加入25 mL 15%三氯乙酸溶液,4 000 r/min離心10 min,取10 mL濾液消化,其余同粗蛋白質的測定(參考GB/T 22492-2008同比例提取,參考QB/T 2653-2004中分離方式)。?


同時,對部分樣品進行了粗蛋白含量的測定,測定方法采用《飼料中粗蛋白測定方法(GB/T 6432-1994)。

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?結果與討論

采用3種方法測定不同單一飼料中的酸溶蛋白含量,并測定樣品中的粗蛋白的含量,檢測結果見2。


1

與普通豆粕相比,發酵豆粕中的酸溶蛋白含量有較大提高,達到10%以上,符合NY/T 2218-2012標準中的要求,與相關文獻報道的結論相符。?

2

分別按照QB/T 2653-2004規定的方法(方法1)和按GB/T 22492-2008的規定改變提取體系及消解液體積后的方法(方法3)對樣品進行測定,結果無顯著差異,說明2個標準中規定的提取體系(稱樣量和溶液體積)以及消解液體積的差異不會對結果產生影響。?

3

分別按GB/T 22492-2008和QB/T 2653-2004規定的方法對不同樣品中的酸溶蛋白進行測定,結果存在顯著差異,對結果進行分析,見1所示。?

? ?從圖1可以看出,采用過濾法(參考GB/T 22492-2008)測得的酸溶蛋白含量顯著高于采用離心法(參考QB/T 2653-2004)測得的酸溶蛋白含量(P0.01),二者存在較好的線性關系(R2=0.999)。針對結果檢測過程分析原因,采用離心后取上清液進行全部轉移測定酸溶蛋白的方法中容易出現離心后上清液不能完全轉移的情況,會導致部分損失,但實際計算時按10 mL全部轉移進行計算,使得結果偏低。王芳等對樣品進行不同的前處理研究結果也表明分離沉降過程是否完全、溶液是否定量轉移對結果的準確性有影響。GB/T 22492-2008標準中將酸溶蛋白測定的樣品前處理分離沉降過程由QB/T 2653-2004標準中的離心法改為過濾法,應該是充分考慮了此因素的結果。

5
? 結論

    在試驗過程中,當采用離心法測定粕類樣品(如豆粕、棉籽粕等)時,大量雜質易漂浮于液面,使分離不完全,最終導致測定結果的不準確與不穩定。因此,根據本研究的結果,建議參考GB/T 22492-2008中規定的方法(過濾法)對要求強制標識的酸溶蛋白指標的7種單一飼料原料產品進行酸溶蛋白的檢測,測定結果穩定可靠。?

    盡快組織制定針對上述7類飼料原料產品中酸溶蛋白的檢測方法標準,以便規范《目錄》中的強制標識。

    進一步擴大檢測范圍,應用確定的檢測方法進行酸溶蛋白的測定,以實際樣品的檢測結果為《目錄》在飼料行業的施行提供技術支持。


?注:本文原文刊登在《中國畜牧雜志》2016年2期,作者為肖志明,李麗蓓,鄧濤,樊霞。如需閱讀本期紙刊更多精彩,可與《中國畜牧雜志》編輯部聯系。如需轉載,請注明出處。


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